Induktion der Ferroptose von Glioblastomzellen durch kombinierte Behandlung mit Chloramphenicol und 2

Scientific Reports Band 13, Artikelnummer: 10497 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Für das Glioblastom, einen bösartigen Tumor, gibt es keine heilende Behandlung. In jüngster Zeit gelten Mitochondrien als potenzielles Ziel für die Behandlung von Glioblastomen. Zuvor haben wir berichtet, dass Wirkstoffe, die eine mitochondriale Dysfunktion auslösen, unter Bedingungen mit Glukosemangel wirksam sind. Daher zielte diese Studie darauf ab, eine auf Mitochondrien ausgerichtete Behandlung zu entwickeln, um normale Glukosebedingungen zu erreichen. In dieser Studie wurden U87MG (U87), U373 und vom Patienten stammende stammähnliche Zellen sowie Chloramphenicol (CAP) und 2-Desoxy-d-Glucose (2-DG) verwendet. Wir untersuchten, ob CAP und 2-DG das Wachstum von Zellen unter normalen und hohen Glukosekonzentrationen hemmten. In U87-Zellen waren die Verabreichung von 2-DG und Langzeit-CAP unter normalen Glukosebedingungen wirksamer als unter Bedingungen mit hohem Glukosespiegel. Darüber hinaus war die kombinierte CAP- und 2-DG-Behandlung bei normaler Glukosekonzentration sowohl unter normalen Sauerstoff- als auch unter hypoxischen Bedingungen signifikant wirksam; Dies wurde in U373 und von Patienten stammenden stammähnlichen Zellen validiert. 2-DG und CAP beeinflussten die Eisendynamik; Deferoxamin hemmte jedoch die Wirksamkeit dieser Wirkstoffe. Somit könnte Ferroptose der zugrunde liegende Mechanismus sein, durch den 2-DG und CAP wirken. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die kombinierte Behandlung von CAP und 2-DG das Zellwachstum von Glioblastom-Zelllinien selbst unter normalen Glukosebedingungen drastisch hemmt; Daher könnte diese Behandlung für Glioblastompatienten wirksam sein.

Das Glioblastom ist einer der bösartigsten Hirntumoren mit einer schlechten Prognose und keiner heilenden Behandlung1,2,3. Temozolomid ist eine Standardbehandlung für Glioblastome; Allerdings verlängert es das Überleben nur um 2,5 Monate3. Darüber hinaus werden Glioblastomzellen resistent gegen Temozolomid, und die Mitochondrien sind mit dieser Resistenz verbunden3,4,5.

Die Mitochondrien sind wichtig für die Adenosintriphosphatproduktion, die Calciumdynamik, die β-Oxidation und die Erzeugung reaktiver Sauerstoffspezies6. Mitochondrien werden auch mit verschiedenen Krankheiten in Verbindung gebracht, darunter auch mit bösartigen Tumoren, insbesondere in Krebsstammzellen7,8. Daher untersuchten wir eine auf Mitochondrien ausgerichtete Behandlung des Glioblastoms.

Unsere vorherige Studie ergab, dass antimikrobielle Wirkstoffe, einschließlich Chloramphenicol (CAP) und Doxycyclin, bei der Behandlung von Glioblastomen unter Bedingungen mit Glukosemangel wirksam sind, da Glioblastomzellen in diesem Zustand von den Mitochondrien abhängig werden9. Eine dreitägige Verabreichung dieser antimikrobiellen Wirkstoffe war bei normalen oder hohen Glukosekonzentrationen wirkungslos9. Daher zielten wir in dieser Studie darauf ab, eine wirksame Behandlung für Glioblastome bei normaler Glukosekonzentration zu entwickeln.

2-Desoxy-d-glucose (2-DG), ein Glucoseanalogon, hemmt die Hexokinase- und Phosphoglucose-Isomerase-Aktivitäten und blockiert so die Glykolyse10. Darüber hinaus ahmt 2-DG Zustände mit Glukosemangel nach, induziert mitochondrialen oxidativen Stress und hemmt das Wachstum von Krebszellen10. Obwohl Singh et al.11 über eine kombinierte Behandlung mit 2-DG und Strahlentherapie zur Behandlung von Glioblastomen berichteten, wird dieser Ansatz in der klinischen Praxis nicht angewendet. Allerdings wurde 2-DG in einigen klinischen Studien zur Behandlung von Krebs oder soliden Tumoren eingesetzt12,13.

In der Tumorumgebung existieren Zellen unter glukosearmen und hypoxischen Bedingungen, was bei der Entwicklung von Behandlungen für Glioblastome berücksichtigt werden sollte14,15. In dieser Studie wurde die Wirksamkeit der Behandlung sowohl unter normalen als auch unter hypoxischen Bedingungen untersucht. Darüber hinaus wurden Ergebnisse der Zelllinienanalyse anhand stammähnlicher Zellen validiert, die einen In-vivo-Zustand nachahmen.

Die Mechanismen, die dem durch jeden Wirkstoff verursachten Zelltod zugrunde liegen, variieren, einschließlich Apoptose, Nekroptose und Ferroptose9,16. Ferroptose ist eine Form des Zelltods, die derzeit große Aufmerksamkeit erregt. In unserer vorherigen Studie führte CAP unter Glukosemangelbedingungen zum Zelltod durch Ferroptose9. Ferroptose weist verschiedene Marker auf, darunter FTH1, GpX4, KEAP1 und NRF2. Darüber hinaus stehen mRNA, PTGS2, CHAC1 und HO-1 im Zusammenhang mit Ferroptose17. Einer der Inhibitoren des Ferroptosewegs ist Deferoxamin (DFO)9.

Ziel dieser Studie war es, die Wirksamkeit einer auf Mitochondrien gerichteten Behandlung unter normalen Glukosebedingungen zu untersuchen. Wir haben die Wirksamkeit von CAP und 2-DG einzeln und in Kombination untersucht. Darüber hinaus untersuchten wir die Mechanismen, die dem durch diese Wirkstoffe verursachten Zelltod zugrunde liegen.

In unserer vorherigen Studie war CAP nur unter Glukosemangelbedingungen innerhalb von 3 Tagen wirksam und nicht unter normalen oder hohen Glukosebedingungen9. Daten zur Sauerstoffverbrauchsrate (OCR) zeigten jedoch, dass die oxidative Phosphorylierung (OXPHOS) bei normalen Glukosekonzentrationen stärker aktiviert war als bei hohen Glukosekonzentrationen9. Unter Berücksichtigung dieses Ergebnisses untersuchten wir die Wirkung einer langfristigen CAP-Verabreichung. Wir beobachteten, dass die 7-tägige Verabreichung von CAP unter normalen Glukosebedingungen wirksamer war als unter hohen Glukosebedingungen (Abb. 1a, b). Obwohl Zellen bei normalen Glukosekonzentrationen absterben, war dieser Effekt bei hohen Glukosekonzentrationen geringer, was die Bedeutung der Glukosekontrolle während der Behandlung unterstreicht.

Wirkungen von Chloramphenicol (CAP) und 2-Desoxy-d-glucose (2-DG) unter verschiedenen Glukosebedingungen. (a) Die Wirkung der 7-tägigen Verabreichung von CAP in U87 (2 × 104 Zellen wurden ausgesät) unter normalen (1000 mg/L) und hohen (4500 mg/L) Glukosebedingungen. CAP ist unter normalen Glukosebedingungen wirksam. (b) Die Zellzahl mit CAP bei Glukosekonzentrationen von 1000 und 4500 mg/L im Vergleich zur Kontrolle zeigt, dass CAP unter normalen Glukosebedingungen wirksam ist (Zellen wurden in einer Platte mit sechs Vertiefungen ausgesät und mit einem Coulter-Zähler gezählt). (c) Die Wirkung der dreitägigen Verabreichung von 2-DG bei U87 unter normalen und hohen Glukosebedingungen; 2-DG ist bei einer Glukosebedingung von 1.000 mg/L wirksam. (d) Die Zellzahl mit 2-DG bei normalen und hohen Glukosekonzentrationen im Vergleich zur Kontrolle zeigt, dass 2-DG unter normalen Glukosebedingungen wirksam ist (Zellen wurden in einer Platte mit sechs Vertiefungen ausgesät und mit Trypanblau gezählt). Die Werte werden als Mittelwert ± Standardabweichung dargestellt. Der Student-T-Test wurde unter normalen Glukosebedingungen im Vergleich zu hohen Glukosebedingungen durchgeführt. ***P < 0,001, ****P < 0,0001.

Anschließend verwendeten wir 2-DG, da es die Glykolyse hemmt und so Zustände mit Glukosemangel nachahmt10. Darüber hinaus wurde 2-DG zur Behandlung von Krebs und soliden Tumoren in Betracht gezogen12,13. Wir gingen davon aus, dass 2-DG allein oder in Kombination mit CAP das Zellwachstum hemmen würde. Die 3-tägige Verabreichung von 2-DG verringerte die Zellzahl bei normalen Glukosekonzentrationen (Abb. 1c, d). Die Wirkung dieses Arzneimittels wurde auch unter Bedingungen mit hohem Glukosespiegel verringert.

Wir stellten die Hypothese auf, dass die kombinierte Behandlung von CAP und 2-DG wirksam ist, und beurteilten daher, ob die Glioblastomzellen nach 3- und 5-tägiger Verabreichung dieser Wirkstoffe abnahmen. Die kombinierte Behandlung war wirksam und das Zellwachstum wurde unter normalen Glukosebedingungen gehemmt (Abb. 2a, b, ergänzende Abb. S1a – d). Darüber hinaus zeigte die Zellzahl Kombinationseffekte bei CAP und 2-DG. Unter hohen Glukosekonzentrationen nahm jedoch die Wirksamkeit der Kombinationstherapie ab (Abb. 2c,d). Diese kombinierte Behandlung ist wirksam, da 2-DG zu Glukosemangelzuständen führt.

Auswirkungen einer kombinierten Behandlung, einschließlich Chloramphenicol (CAP) und 2-Desoxy-d-Glucose (2-DG), unter verschiedenen Glukosebedingungen. (a) Die Wirkung der 5-tägigen Verabreichung von CAP und 2-DG bei U87 unter normalen Glukosebedingungen. Die kombinierte Behandlung war wirksam. (b) Zellzahl mit jedem Wirkstoff unter einer Glukosekonzentration von 1000 mg/l (Zellen wurden in einer Platte mit sechs Vertiefungen ausgesät und mit einem Coulter-Zähler gezählt). (c) Die Wirkung der 5-tägigen Verabreichung von CAP und 2-DG bei U87 unter Bedingungen mit hohem Glukosespiegel. (d) Zellzahl mit jedem Wirkstoff unter einer Glukosekonzentration von 4500 mg/l (Zellen wurden in einer Platte mit sechs Vertiefungen ausgesät und unter Verwendung eines Coulter-Zählers gezählt). Die Werte werden als Mittelwert ± Standardabweichung dargestellt. Die statistische Signifikanz wurde mithilfe des gewöhnlichen Einweg-Varianzanalysetests mit Tukeys Mehrfachvergleichstest bewertet, bei dem Ct vs. CAP vs. 2-DG vs. CAP + 2-DG bewertet wurde. **P < 0,01, ***P < 0,001, ****P < 0,0001.

Die COX1-Expression nahm nach der Verabreichung von 2-DG zu (Abb. 3a, b). Daher haben wir die OCR überwacht, um OXPHOS zu bewerten, und festgestellt, dass die OCR unter 2-DG-Verabreichung höher war als unter der Kontrolle und dass die OCR in der CAP-Gruppe abnahm (Abb. 3c, d). In Anbetracht dieser Ergebnisse ahmt 2-DG Zustände mit Glukosemangel nach und erhöht so die Wirksamkeit von CAP. Anschließend gehen wir davon aus, dass dieser Nährstoffmangel zu einer Erhöhung der Aktivität der Fettsäureoxidation zur Energieerzeugung führt. Um die aus der Fettsäureaktivierung resultierende OCR nachzuweisen, wurde Etomoxir, ein Carnitin-Palmitoyltransferase-1A-(CPT1A)-Inhibitor, verwendet18,19. Die OCR nahm ab, wenn Etomoxir injiziert wurde (ergänzende Abbildung S2a, b).

2-Desoxy-d-glucose (2-DG) macht die Mitochondrien der Zelle dominant und erhöht die Sauerstoffverbrauchsrate (OCR). (a) 2-DG erhöhte die Expression von COX1 in U87 nach 3 Tagen. (b) Quantifizierung der COX1-Expression (N = 3). Die Werte werden als Mittelwert ± Standardabweichung dargestellt. Der Student-T-Test wurde unter normalen Glukosebedingungen im Vergleich zu hohen Glukosebedingungen durchgeführt. **P < 0,01. (c) Spuren von OCR in jedem verabreichten Wirkstoff und (d) Quantifizierung der maximalen Atmung. Zur Beurteilung von Ct vs. CAP vs. 2-DG vs. CAP + 2-DG wurde eine gewöhnliche einseitige Varianzanalyse mit Tukeys Mehrfachvergleichstest durchgeführt. *P < 0,05, **P < 0,01, ****P < 0,0001.

In der biologischen Umgebung existieren Zellen unter hypoxischen und nährstoffarmen Bedingungen14,15. Wir beurteilten, ob die Wirksamkeit einer kombinierten Behandlung unter hypoxischen Bedingungen (O2 = 1 % ausreicht, um eine hypoxische Reaktion auszulösen (ergänzende Abbildung S3a, b) und stellten fest, dass das Zellwachstum unter normalen Glukosebedingungen gehemmt wurde (Abb. 4a, b). Darüber hinaus waren die Wirkungen von CAP und 2-DG positiv; bei hoher Glukosekonzentration war ihre Wirksamkeit jedoch verringert (Abb. 4c, d).

Auswirkungen einer kombinierten Behandlung, einschließlich Chloramphenicol (CAP) und 2-Desoxy-d-Glucose (2-DG), unter verschiedenen Glukosebedingungen bei Hypoxie. (a) Die Wirkung der 5-tägigen Verabreichung von CAP und 2-DG bei U87 unter normalen Glukosebedingungen bei Hypoxie (O2 = 1 %). Die kombinierte Behandlung war wirksam. (b) Zellzahl mit jedem Wirkstoff unter einer Glukosekonzentration von 1000 mg/l (Zellen wurden in einer Platte mit sechs Vertiefungen ausgesät und mit einem Coulter-Zähler gezählt). (c) Die Wirkung der 5-tägigen Verabreichung von CAP und 2-DG bei U87 unter Bedingungen mit hohem Glukosespiegel. (d) Zellzahl mit jedem Wirkstoff unter einer Glukosekonzentration von 4500 mg/l (Zellen wurden in einer Platte mit sechs Vertiefungen ausgesät und unter Verwendung eines Coulter-Zählers gezählt). Die Werte werden als Mittelwert ± Standardabweichung dargestellt. Die statistische Signifikanz wurde mithilfe des gewöhnlichen Einweg-Varianzanalysetests mit Tukeys Mehrfachvergleichstest bewertet, bei dem Ct vs. CAP vs. 2-DG vs. CAP + 2-DG bewertet wurde. **P < 0,01, ***P < 0,001, ****P < 0,0001.

Schließlich verwendeten wir von Patienten stammende stammähnliche Zellen, um die Wirkung einer Behandlung zu validieren, die einen In-vivo-Zustand nachahmt. Obwohl die einmalige Verabreichung von CAP oder 2-DG unwirksam war, war eine kombinierte Behandlung in Neurosphärenzellen wirksam (Abb. 5a, b). Die Neurosphären waren kleiner und die Anzahl der Kugeln nahm ab (Ergänzende Abbildung S4a, b).

Auswirkungen einer kombinierten Behandlung in vom Patienten stammenden stammähnlichen Zellen. (a) Die Wirkung der 7-tägigen Verabreichung von Chloramphenicol (CAP) und 2-Desoxy-d-glucose (2-DG) in KNS1451 unter normalen Glukosebedingungen. Die kombinierte Behandlung war wirksam. (b) Zellzahl mit jedem Wirkstoff unter einer Glukosekonzentration von 1000 mg/l (Zellen wurden in einer Platte mit sechs Vertiefungen ausgesät und mit Trypanblau gezählt). Die Werte werden als Mittelwert ± Standardabweichung dargestellt. Die statistische Signifikanz wurde mithilfe des gewöhnlichen Einweg-Varianzanalysetests mit Tukeys Mehrfachvergleichstest bewertet, bei dem Ct vs. CAP vs. 2-DG vs. CAP + 2-DG bewertet wurde. **P < 0,01.

Wir untersuchten die Mechanismen, die der Wirksamkeit einer kombinierten Behandlung zugrunde liegen. Wie bereits berichtet, führt die CAP-Injektion unter Glukosemangelbedingungen zum Zelltod durch Ferroptose9. Daher stellten wir die Hypothese auf, dass Ferroptose der Wirksamkeit einer kombinierten Behandlung zugrunde liegt. Während der CAP-Verabreichung stieg der mRNA-Spiegel der Ferroptosemarker, einschließlich PTGS2 und CHAC1, an (Abb. 6a, b, ergänzende Abb. S5a). In Bezug auf die mRNA der HO-1-Spiegel erhöhte sich auch einer der Marker im Zusammenhang mit der Eisendynamik bei der Verabreichung von 2-DG (Abb. 6c). Die mRNA-Spiegel von FTH1 steigen bei der Behandlung mit einem der beiden Wirkstoffe. Bei kombinierter Behandlung wurde jedoch der höchste Gehalt an FTH1-mRNA beobachtet, was die Kombinationswirkung dieser beiden Wirkstoffe zeigt (Abb. 6d, ergänzende Abb. S5b). Darüber hinaus zeigte die Expression von Ferroptose-verwandten Proteinen, einschließlich FTH1, GpX4 und KEAP1, einen Kombinationseffekt (Abb. 6e – h). Insbesondere die Expression von FTH1 und GpX4 erhöhte sich unter Verwendung von CAP und 2-DG. Allerdings nahm die Expression von KEAP1 sowohl bei Verwendung von CAP als auch von 2-DG ab. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die beiden Wirkstoffe CAP und 2-DG drastische Veränderungen der Eisendynamik verursachen und dass Ferroptose einer der Wege ist, die zum Zelltod führen. Um die Möglichkeit anderer Arten des Zelltods, einschließlich Apoptose, auszuschließen, führten wir eine Immunblotting-Analyse durch, um die Expression von Caspase-3 zu bestimmen, was Apoptose impliziert (ergänzende Abbildung S6a, b). Darüber hinaus war auch eine kombinierte Behandlung mit 2-DG und anderen Ferroptose-Induktoren, nämlich Natriumselenit, wirksam (ergänzende Abbildung S7a, b)9,20.

Die Eisendynamik wurde durch beide Wirkstoffe drastisch verändert. Eine Veränderung der Ferroptose wurde nach der 5-tägigen Verabreichung von Chloramphenicol (CAP) und 2-Desoxy-d-glucose (2-DG) bei U87 beobachtet. (a,b) Quantifizierung der PTGS2- und CHAC1-mRNA-Expression (N = 3). (c) Quantifizierung der HO-1-mRNA-Expression (N = 3). (d) Quantifizierung der FTH1-mRNA-Expression (N = 3). (e) Western Blot zeigt, dass die FTH1- und GpX4-Spiegel in beiden Wirkstoffen anstiegen, wohingegen die KEAP1-Spiegel in beiden Wirkstoffen abnahmen (N = 3). (f–h) Quantifizierungsergebnisse. Die Werte werden als Mittelwert ± Standardabweichung dargestellt. Zur Beurteilung von Ct vs. CAP vs. 2-DG vs. CAP + 2- wurde der Student-t-Test (a–c,f) oder eine gewöhnliche einseitige Varianzanalyse mit Tukeys Mehrfachvergleichstest (d,g,h) durchgeführt. GD. *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001.

Unter Berücksichtigung der Ergebnisse der mRNA- und Proteinexpression können CAP und 2-DG Ferroptose induzieren, was die Wirksamkeit einer kombinierten Behandlung unterstreicht. Um dies zu beweisen, verwendeten wir DFO, einen Eisenchelatbildner und Ferroptosehemmer. DFO hemmte die Wirkung von CAP (Abb. 7a, b) und die von 2-DG und CAP mit 2-DG (Abb. 7c – e). In Anbetracht dieser Ergebnisse wurde der durch CAP und 2-DG verursachte Zelltod durch DFO gehemmt, und einer der Mechanismen dieser Wirkstoffe ist Ferroptose.

Hemmung der Ferroptose durch Deferoxamin (DFO). (a,b) In U87 zeigt die Zellzahlanalyse, dass Chloramphenicol (CAP) und DFO (50 μM, hinzugefügt 72 Stunden nach der CAP-Injektion) den Zelltod nach 5 Tagen reduzierten. Die Werte werden als Mittelwert ± Standardabweichung dargestellt. (N = 3). (c–e) In U87 ergab der Zellzahltest, dass 2-Desoxy-d-glucose (2-DG) oder CAP + 2-DG und DFO den Zelltod nach 3 Tagen reduzierten, wobei zunächst DFO (50 μM) zugesetzt wurde . Die Werte werden als Mittelwert ± Standardabweichung dargestellt. (N = 3). Es wurde ein Student-T-Test durchgeführt. **P < 0,01, ***P < 0,001.

Über den Zusammenhang zwischen Glioblastom und Mitochondrien ist wenig bekannt. Wir haben uns auf die Mitochondrien konzentriert, da sie wichtige Zielorganellen bei der Behandlung von Glioblastomen sind21. Darüber hinaus gibt es in der Tumorumgebung hypoglykämische und hypoxische Zustände14,15. In unserer vorherigen Studie haben wir uns auf die Entwicklung der Behandlung von Glioblastomen unter hypoglykämischen Bedingungen konzentriert9. Die Ergebnisse dieser früheren Studie waren wie folgt: Mitochondrien wurden unter glukosearmen Bedingungen aktiviert und antimikrobielle Wirkstoffe waren unter glukosearmen Bedingungen wirksam. Da die Tumorumgebung hypoglykämisch ist und es an verschiedenen Nährstoffen mangelt, stellten frühere Erkenntnisse vielversprechende Behandlungen dar. Unter Glukosemangelbedingungen war der Glukosespiegel (100 mg/L) jedoch viel niedriger als unter normalen Glukosebedingungen (1000 mg/L)9. Aufgrund der Tumorheterogenität können einige nährstoffreiche Läsionen einen höheren Glukosespiegel aufweisen als nährstoffarme Läsionen. Es ist wichtig, eine wirksame Behandlung mit verschiedenen Sauerstoffkonzentrationen bei normalen und niedrigen Glukosebedingungen zu entwickeln, um diese bösartigen Tumoren zu bekämpfen. Daher haben wir uns in dieser Studie auf normale Glukose- und hypoxische Zustände konzentriert und eine kombinierte Behandlung mit CAP und 2-DG entwickelt. Diese Behandlung hemmte das Zellwachstum unter normalen Glukosebedingungen sowohl unter normalen als auch unter hypoxischen Bedingungen drastisch. Daher kann eine kombinierte Behandlung für Glioblastompatienten erfolgversprechend sein.

Unseren Ergebnissen zufolge war die kombinierte Behandlung bei hohem Glukosespiegel (4500 mg/l) im Vergleich zu normalen Glukosebedingungen unwirksam, was die Bedeutung der Aufrechterhaltung des Glukosespiegels im normalen Bereich unterstreicht. Laut einer früheren Studie ist der Blutzuckerspiegel mit der Prognose bei Patienten mit Glioblastom verbunden, wobei höhere Glukosespiegel zu schlechteren Prognosen führen22. Darüber hinaus war die OCR unter normalen Glukosebedingungen höher als unter hohen Glukosebedingungen, was darauf hindeutet, dass eine auf Mitochondrien gezielte Therapie unter normalen Glukosebedingungen wirksamer ist als unter hohen Glukosebedingungen9, wobei eine Glukosekonzentration von 1000 mg/l beim Menschen als normal gilt.

Die Blut-Hirn-Schranke (BBB) verhindert, dass einige Wirkstoffe in das Gehirn eindringen23. Daher sollte geprüft werden, ob ein Agent die BBB überschreiten kann. Kürzlich wurden nanotherapeutische Techniken entwickelt, um die BHS zu überwinden und die Behandlung von Glioblastomen zu verbessern23. Aus den verschiedenen verfügbaren Wirkstoffen haben wir zwei Wirkstoffe ausgewählt, CAP und 2-DG, die leicht die BHS passieren und direkt auf die Mitochondrien einwirken können24,25.

CAP ist ein antimikrobieller Wirkstoff, der eine mitochondriale Dysfunktion hervorruft26. Darüber hinaus wurde dieses Mittel zur Behandlung von Meningitis eingesetzt27. Dunkle et al.27 berichteten, dass die effektive Blutkonzentration für Frühgeborene mit einer Infektion des Zentralnervensystems 46–154 μM betrug. Darüber hinaus ist eine Konzentration von 100 μM sinnvoll und weniger schädlich. Darüber hinaus ist bei der Verwendung dieses Mittels mit einer Neupositionierung des Arzneimittels zu rechnen. Metformin wird seit kurzem zur Behandlung von Krebserkrankungen, einschließlich Glioblastomen, eingesetzt28. Kim et al.28 berichteten, dass 2-DG in Kombination mit Metformin die Proliferation von Glioblastomzellen hemmt. Wir untersuchten die Wirkung von Metformin unter Bedingungen mit Glukosemangel und unsere Studie ergab, dass CAP unter Bedingungen mit Glukosemangel wirksam war9, wohingegen Metformin nicht sehr wirksam war (ergänzende Abbildung S8). Dieser Unterschied ist wahrscheinlich auf unterschiedliche Wirkmechanismen dieser beiden Medikamente zurückzuführen. CAP hemmt mitochondriale Ribosomen und verursacht mitochondriale Dysfunktion26. Berichten zufolge hemmt Metformin den Mitochondrienkomplex 1; Es wurde jedoch eine andere Theorie vorgeschlagen, deren genauer Mechanismus noch nicht vollständig aufgeklärt ist29. CAP ist sowohl unter Glukosemangel als auch unter normalen Bedingungen wirksam. Daher glauben wir, dass CAP ein Schlüsselmedikament zur Behandlung von Glioblastomen ist.

2-DG wird zur Behandlung von Krebsarten eingesetzt, die auf die Glykolyse abzielen12. Stein und Raez führten eine klinische Studie zur Behandlung von Krebs oder soliden Tumoren mit 2-DG durch und stellten dessen Sicherheit bei geeigneten Konzentrationen vor. Stein empfahl eine Dosis von 45 mg/kg, während Raez eine sichere Dosis von 63 mg/kg/Tag empfahl12,13. Darüber hinaus beträgt die Cmax einer Dosis von 45 mg/kg 73,7 μg/ml (449 μM), während die einer Dosis von 63 mg/kg/Tag 116 μg/ml (fast 700 μM) beträgt. Allerdings berichteten Sasaki et al.30, dass 2-DG zwar erfolgreich Krebs behandelt, wirksame Dosen jedoch schwerwiegende Nebenwirkungen hervorrufen. Sie empfahlen daher ein neues Gerät, das 2-DG in Polymilch-Co-Glykolsäure-Nanopartikeln liefert. In unserer Studie lag die Konzentration von 2-DG bei 300 μM, was im sicheren Bereich liegt.

2-DG hemmt die Glykolyse und sorgt für Bedingungen, die einem Glukosemangel ähneln. Wie bereits berichtet, werden bei Glukosemangel die Mitochondrien dominant. 2-DG erhöht auch die Expression von COX1 und OXPHOS, was auf eine mitochondriale Dominanz schließen lässt. Darüber hinaus gehen wir davon aus, dass dieser Nährstoffmangel zu einer erhöhten Aktivität der Fettsäureoxidation führt und gehen davon aus, dass der OXPHOS-Anstieg auf Fettsäureaktivierungen zurückzuführen ist. Etomoxir wird zum Nachweis der Aktivität der Fettsäureoxidation verwendet und es wird berichtet, dass hochdosiertes Etomoxir den Mitochondrienkomplex 131 hemmt. OXPHOS nahm nach der Etomoxir-Injektion ab, obwohl die Abnahme geringer war als erwartet. Daher kann es andere Wege geben, einschließlich des Aminosäureweges. Um dies zu klären, sind weitere Untersuchungen erforderlich.

Basierend auf den Studienergebnissen könnte es zu Ferroptose gekommen sein. Kürzlich wurde über mehrere Ferroptosemarker berichtet, darunter KEAP1, NRF2, HO-1, GpX4, TFRC, FTH1 und xCT17. Eine frühere Studie hat gezeigt, dass CAP Ferroptose über den p-p62-KEAP1-NRF2-HO-1-Signalweg induziert9. In dieser Studie haben wir zwei verschiedene Wirkstoffe verwendet; Daher war es schwierig, die Existenz eines einzelnen Ferroptosestroms zu bestätigen. Allerdings beeinflussten die beiden Wirkstoffe die Eisendynamik drastisch und zeigten eine Kombinationswirkung auf FTH1, GpX4 und KEAP1. Um außerdem zu bestätigen, ob diese Wirkstoffe Ferroptose induzieren, ist es wichtig, einen Inhibitor dieses Signalwegs zu verwenden; Wir haben DFO entsprechend verwendet. DFO hemmte beide Wirkstoffe und wir glauben, dass der Mechanismus, der dem Zelltod in diesem Fall zugrunde liegt, Ferroptose ist. In dieser Studie untersuchten wir andere Wege des Zelltods, einschließlich Apoptose und Nekroptose. Die Expression von Caspase 3, die Apoptose impliziert, wurde bei jedem Wirkstoff nicht verändert. Darüber hinaus wurde kein Anstieg des RIP3K-mRNA-Spiegels festgestellt, der mit Nekroptose zusammenhängt. Darüber hinaus könnte ein Grund dafür, dass 2-DG Ferroptose verursacht, darin liegen, dass Glukosemangel die Blockierung des Serinsynthesewegs induziert, einem Weg, der von der Glykolyse abgeleitet ist32. Dies führt zum Abbau von Glutathion, einem Aktivator von GpX4, der vor Ferroptose schützt33.

Eine Einschränkung dieser Studie besteht darin, dass die Daten in vitro und nicht in vivo gesammelt wurden; Daher sind weitere In-vivo-Studien an Mäusen erforderlich. Es lohnt sich jedoch, über die Entwicklung einer wirksamen Behandlung zu berichten. Zusammenfassend haben wir eine wirksame Behandlung entwickelt, die CAP mit 2-DG kombiniert, um Glioblastomzelllinien unter normalen Glukosebedingungen zu behandeln. Daher scheinen die Ergebnisse unserer Studie für die Entwicklung von Therapien für Glioblastome von Nutzen zu sein.

U87MG (U87) und U373 wurden von der American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA) erhalten (zertifiziert von BEX [Japan]). Die Verwendung von Zelllinien für diese Studie wurde von der Ethikkommission der Graduate School of Medical Science der Kyushu-Universität genehmigt. Von allen Patienten wurde eine schriftliche Einwilligung eingeholt.

Die Zellen wurden wie bereits berichtet9 kultiviert. In ähnlicher Weise wurde eine ursprüngliche, von einem Patienten stammende Glioblastomzelllinie, KNS1451, die von der Kyushu University Brain Tumor Bank erhalten wurde, wie bereits berichtet kultiviert9. Die genetische Analyse ergab, dass KNS1451 Mutationen wie Phosphatase und Tensin-Homolog, Tumorprotein 53, Neurofibromatose 1 und den Telomerase-Reverse-Transkriptase-Promotor C250T enthielt. Diese Zelllinie wird als aggressiver mesenchymaler Typ klassifiziert.

Die Echtzeit-PCR wurde wie zuvor beschrieben durchgeführt9. Ribosomale 18S-rRNA wurde als interne Kontrolle bewertet. Primersequenzen sind in der Ergänzungstabelle S1 aufgeführt.

Die Immunblotting-Analyse wurde wie zuvor beschrieben durchgeführt9. Die folgenden Antikörper wurden in dieser Studie verwendet: monoklonaler Maus-Anti-MTCO1 (#ab14705, Abcam, RRID:AB_2084810), monoklonaler Maus-Anti-β-Actin (#A5441, Sigma-Aldrich, RRID_2766243), polyklonaler Kaninchen-Anti-GPX4 (# 52455, CST, RRID:AB_2924984), monoklonaler Kaninchen-Anti-KEAP1 (#8047, CST, RRID:AB_10860776), polyklonaler Kaninchen-Anti-FTH1 (#3998, CST), polyklonaler Kaninchen-Anti-Caspase-3 (#9662, CST) , monoklonaler Kaninchen-Anti-HIF-1α-Antikörper (#14179, CST, RRID:AB_2622225), Anti-Kaninchen-IgG-HRP-gekoppelt (#7074, CST) und Anti-Maus-IgG-HRP-gekoppelt (#7076, CST). Die Membranen wurden vor der Hybridisierung mit Antikörpern geschnitten.

Die Zellen wurden dreifach ausgesät (1 × 105 in einer Schale mit 6 Vertiefungen, mit Ausnahme der in Abb. 1, in der 2 × 104 Zellen ausgesät wurden) und in DMEM (enthaltend Glucose, CAP (034-10572, Wako), 2) kultiviert -DG (D8375, Sigma-Aldrich), DFO (205-314-3, Sigma-Aldrich), SS (10102-18-8, WAKO) und Metformin (1115-70-4, Tokyo Chemical Industry) in jeder Konzentration Dieses Kulturmedium wurde alle 3 Tage ausgetauscht; die Zellen wurden trypsiniert und unter Verwendung eines Coulter-Zählers (Beckman Coulter, USA) oder eines automatisierten Zellzählers TC 20 (BIO-RAD, Nr. 1450101J1, USA) mit Trypanblau gezählt. Um die Proliferation zu beurteilen Von stammähnlichen Zellen wurden die Zellen (5 × 104 in einer Schale mit 6 Vertiefungen) in dreifacher Ausfertigung oder mehr ausgesät und in DMEM/Ham's F12 (enthaltend CAP und 2-DG in jeder Konzentration) für 7 Tage kultiviert. Am 7 Tag wurden Anzahl und Größe der Kugeln bestimmt. Nach 2-minütiger Zentrifugation bei 3000 × g wurden die Zellpellets trypsinisiert, zum Medium gegeben und unter Verwendung des automatischen Zellzählers TC 20-Cell mit Trypanblau gezählt.

Hypoxische Bedingungen wurden mit einem persönlichen CO2-Mehrgas-Inkubator (ASTEC) mit 1 % O2 und 5 % CO2 erreicht. Die O2-Konzentration wurde automatisch mit einem automatischen Gasflaschenwechsler (Modell 8420, Waken) überprüft.

Mitochondriales OXPHOS und die glykolytische Aktivität können mithilfe der OCR-Methoden mit einem XFe24-Analysegerät (Seahorse Biosciences, USA) gemessen werden. Die basale OCR wurde wie zuvor beschrieben mit dem Seahorse XF24 Flux-Analysator gemessen9. Darüber hinaus kann die Fettsäureaktivität mit 40 μM Etomoxir (#1905, Sigma-Aldrich) und 0,5 mM L-Carnitin (#541-15-1, TCI) gemessen werden18,19. Seahorse XF24-Mikrotiterplatten wurden mit 1 × 105 Zellen/Vertiefung ausgesät (vor der Aussaat wurden die Zellen unter jeder Bedingung 2 Tage lang inkubiert) und etwa 16 Stunden lang bei 37 °C inkubiert. Nach der Analyse wurden die Zellen mit einer ähnlichen Anzahl von Zellen in einer anderen 96-Well-Platte ausgesät, trypsiniert und zu Beginn der Analyse gezählt. Die Ergebnisse wurden auf die Anzahl der Zellen normalisiert.

Statistische Auswertungen werden in den Abbildungslegenden beschrieben. Die Daten werden als Mittelwert ± Standardabweichung dargestellt. Signifikante Unterschiede zwischen den Gruppen wurden mithilfe einer einseitigen Varianzanalyse oder des Student-t-Tests mit GraphPad Prism Version 9 (GraphPad Prism Software Inc.) untersucht. Alle Experimente wurden mindestens dreimal wiederholt.

Alle während dieser Studie generierten oder analysierten Daten sind enthalten.

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Diese Arbeit wurde von der Japan Society for the Promotion of Science (JSPS) KAKENHI Grant Numbers (JP20H00530, JP21K11678, JP22H03537) unterstützt.

Abteilung für klinische Chemie und Labormedizin, Graduate School of Medical Sciences, Kyushu University, Higashi-Ku, Fukuoka, 812-8582, Japan

Kenji Miki, Mikako Yagi, Yura Do, Dongchon Kang und Takeshi Uchiumi

Abteilung für Neurochirurgie, Graduate School of Medical Sciences, Kyushu University, Higashi-Ku, Fukuoka, 812-8582, Japan

Kenji Miki, Naoki Noguchi, Ryosuke Otsuji, Daisuke Kuga und Koji Yoshimoto

Abteilung für Gesundheitswissenschaften, Graduate School of Medical Sciences, Kyushu University, Higashi-Ku, Fukuoka, 812-8582, Japan

Mikako Yagi und Takeshi Uchiumi

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KM-Experiment, Datenkuration, Datenanalyse, Methodik und Überarbeitung des Manuskriptschreibens; MEINE Methodik, Betreuung, Ressourcen und Finanzierung; NN und RO Bereitstellung klinischer Proben; YD-Aufsicht; DK-Überwachung und Bereitstellung klinischer Proben; DK-Methodik, Aufsicht, Ressourcen und Finanzierung; KY-Konzeptualisierung, Methodik, Überwachung und Überarbeitung; TU-Konzeptualisierung, Betreuung, Ressourcen, Finanzierung und Überarbeitung.

Korrespondenz mit Takeshi Uchiumi.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Miki, K., Yagi, M., Noguchi, N. et al. Induktion der Ferroptose von Glioblastomzellen durch kombinierte Behandlung mit Chloramphenicol und 2-Desoxy-d-Glucose. Sci Rep 13, 10497 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-37483-5

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Eingegangen: 25. Januar 2023

Angenommen: 22. Juni 2023

Veröffentlicht: 28. Juni 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-37483-5

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